Der Matilda II war in wenigen Exemplaren bereits in Frankreich zum Einsatz gekommen. Er verfügte über eine 2-Pfünder-Kanone, die gegen jeden deutschen Panzer dieser Zeit wirksam eingesetzt werden konnte, als sekundäre Waffe wurde das BESA-Maschinengewehr genutzt. Zudem war die Panzerung auf bis zu 90 Millimeter verstärkt worden. Gegen den Matilda II waren die meisten deutschen Waffen wirkungslos, einzig die 8,8-cm-Flak war in der Lage, die Panzerung des Matilda II zu durchschlagen.
Insbesondere an der nordafrikanischen Front erwies sich der Matilda anfangs als sehr wirkungsvolle Waffe, die den italienischen Panzern M13/40, M11/39 und L3/33 überlegen war. Da der Matilda II jeden italienischen Panzer der Zeit um 1940 zerstören konnte, ohne selbst gefährdet zu werden, erhielt er den Spitznamen „Queen of the desert“. Im späteren Verlauf des Afrikafeldzugs – ab März 1941 kämpften Truppen bzw. Panzer der Wehrmacht – zeigte sich jedoch, dass auch der Matilda II den Anforderungen nicht mehr gerecht wurde. Das deutsche Afrikakorps hatte modernere Panzer, deren verbesserter Panzerschutz der 2-Pfünder-Kanone des Matilda auf weite Entfernung widerstand. Aufgrund der geringen Geschwindigkeit des Matilda II, der nur 25-30 km/h (je nach Bodenlage und Zusatzgewicht) erreichte und damit auch langsamer als seine deutschen Gegner war, konnte der Matilda nicht in günstige Schussdistanzen gegen deutsche Panzer gelangen. Verheerend wurde diese Schwachstelle, wenn der Matilda auf die deutsche 8,8-cm-Flak in ihrer Rolle als Panzerabwehrgeschütz traf. Die „Acht-Acht“ konnte einen Matilda auf eine Distanz von 1.800 Metern zerstören, der seinerseits auf mindestens 500 Meter an die Geschützstellung herankommen musste, um das Feuer erwidern zu können. Dies war in einer Wüstenlandschaft, die kaum Deckung bietet, ein deutlicher Nachteil für den Panzer.
Der Matilda wurde daher in Nordafrika ab Ende 1941 schrittweise durch den beweglicheren Valentine abgelöst, indem ausgefallene Fahrzeuge nicht mehr ersetzt wurden. Die australische Armee setzte ihre Matildas auf dem Pazifischen Kriegsschauplatz bis zum Kriegsende ein.
Von 1939 bis August 1943 wurden etwa 3000 Stück dieses Kampfwagens von Vulcan Foundry sowie mehreren Lizenznehmern hergestellt. Rund 1100 Matildas wurden an die Sowjetunion geliefert.